近日，生物學(xué)院林木遺傳育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室安新民教授團(tuán)隊(duì)在楊樹無痕編輯領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展，該研究創(chuàng)新性地構(gòu)建了集可視化監(jiān)測系統(tǒng) (RUBY)、多基因編輯 (CRISPR/Cas9-sgRNAs)、外源 DNA清除系統(tǒng)(LoxP::FRT/FLP)的“三位一體”可視化無痕編輯系統(tǒng) (Visual Monitoring DNA-Free Multi-Gene Editing System, VMDFGE)，相關(guān)成果發(fā)表于Plant Biotechnology Journal（一區(qū)，Top期刊）。
CRISPR-Cas9系統(tǒng)已成為用于精準(zhǔn)基因組編輯的強(qiáng)大“分子手術(shù)刀”，深刻變革了植物遺傳與育種，推動(dòng)了植物種質(zhì)創(chuàng)新與品種改良。隨著基因編輯技術(shù)的不斷進(jìn)步和完善，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠同時(shí)編輯多個(gè)基因。然而，解決基因編輯后殘留編輯組件的問題、提高篩選效率以及建立一種穩(wěn)定高效、不含外源轉(zhuǎn)基因元件的基因編輯技術(shù)至關(guān)重要。
研究整合了三個(gè)系統(tǒng)：熱誘導(dǎo)外源基因切除系統(tǒng)、多基因編輯系統(tǒng)和可視化系統(tǒng)。通過切除T-DNA border (TB)內(nèi)的片段并重新設(shè)計(jì)對其進(jìn)行修飾。在TB后1 bp處插入LoxP和FRT 重組位點(diǎn)，以利于中間序列的切除。重組酶系統(tǒng)設(shè)計(jì)使用HSP熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子進(jìn)行溫控啟動(dòng)，使元件能夠從編輯后的轉(zhuǎn)基因植物中移除。多基因編輯系統(tǒng)采用了CRISPR Cas9/Csy4 系統(tǒng) (Csy4-Cleavable Cassettes)，該系統(tǒng)對多基因編輯效率高，并對Cas9 蛋白序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。同時(shí)，可視化整合了RUBY系統(tǒng)，并添加了Kozak序列以增強(qiáng)RUBY基因表達(dá)和篩選效率。在適當(dāng)?shù)臏囟日T導(dǎo)下，F(xiàn)LP重組酶在識(shí)別位點(diǎn)切割基因組DNA，只留下‘LB-LoxP::FRT-RB’結(jié)構(gòu)，而外源基因刪除系統(tǒng)、基因編輯系統(tǒng)和可視化系統(tǒng)將從宿主基因組中被切除并降解代謝。
該研究最終在84K楊中實(shí)現(xiàn)了75.0%的可視化篩選效率、45.8%的多基因編輯率及54.5%的外源DNA切除效率。這一技術(shù)不僅攻克了傳統(tǒng)CRISPR系統(tǒng)中脫靶效應(yīng)、編輯元件及篩選標(biāo)記殘留的安全性難題，更為多年生木本植物提供了穩(wěn)定的“編輯后無轉(zhuǎn)基因痕跡”的分子育種新工具，有望推動(dòng)基因編輯植物新品種監(jiān)管批準(zhǔn)和商業(yè)化進(jìn)程。
北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院博士生吳茹茜為論文第一作者，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院安新民教授與秦德彬講師為該研究工作共同通訊作者。
研究工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD2200101）、農(nóng)業(yè)生物育種重大項(xiàng)目（2022ZD0401503）、國家自然科學(xué)基金（31870652, 31570661）、國家自然科學(xué)基金青年基金（32100196）等項(xiàng)目的資助。
